吃。 丘迪诺夫普拉托诺夫(A.V.) S.N.亚历山德罗娃伊兰斯基
最近显示,子囊真菌伊兰氏菌能够感染马铃薯块茎。 这项工作是首次分析从马铃薯中分离出的I. crassa菌株的生物学特性和对某些杀真菌剂的抗性。 “马铃薯”菌株的物种特异性区域序列与早先从黄水仙,人参,白杨和山毛榉,百合鳞茎和郁金香叶的根中分离出的真菌获得的序列一致。 显然,许多野生和园林植物都可以作为crassa的储备。 被调查的菌株感染了番茄和马铃薯切片,但没有感染整个番茄果实和完整的马铃薯块茎。 这表明I. crassa是伤口寄生虫。 在营养培养基上对氟狄莫尼,二苯并康唑和嘧菌酯的抗性评估表明这些药物具有很高的功效。
EC50指标(杀菌剂的浓度,相对于杀菌剂对照,其浓度降低了菌落径向生长速率的2倍)等于0.4; 分别为7.4和4 mg / l。 在马铃薯块茎的植物病理学评估和植物保护措施的制定中,应考虑由克雷萨氏菌引起的疾病发展的可能性。
植物致病性微生物的发展导致马铃薯生长和储存各个阶段的大量损失。 通常,在制定保护措施时,要考虑到众所周知的病原体,例如链格孢属,镰刀菌属,番茄,蠕虫科,炭疽菌,疫霉菌等。然而,近年来,关于马铃薯上新的植物病原微生物的出现越来越多的报道。 它们的生物学研究很差,与马铃薯相关的杀菌剂的功效尚不清楚,诊断方法尚未开发。 随着大规模发展,它们能够对马铃薯作物造成重大损害。 这些微生物中的一种是子囊菌真菌Ilyonectria crassa(Wollenw.A。
这项工作介绍了从马铃薯块茎中分离出的I. crassa菌株的分析结果。 研究了Crassa I.菌群的菌落和菌丝体结构,物种特异性DNA区域的核苷酸序列,对土豆和西红柿的毒力以及对某些流行的杀菌剂的抗性。
材料和方法
我们使用了18年从在Kostroma地区种植的受感染马铃薯块茎中分离出的I. crassa 2KSuPT2018菌株。 块茎受干腐病的影响,其空腔覆盖着浅棕色菌丝体。 用无菌解剖针将真菌菌丝体转移到带有琼脂培养基(啤酒麦芽汁10%,琼脂1.5%,青霉素1000 U / ml)的培养皿中。 将平板在黑暗中于24°C孵育。
使用带ICC2500 HD数码相机的Leica DM50光学显微镜和带IC80HD数码相机的Leica M80双目显微镜(德国Leica Microsystems)拍摄,评估孢子和孢子器官的大小和形态。
为了分离DNA,将真菌菌丝体在豌豆培养基中生长,然后在液氮中冷冻,匀浆,在CTAB缓冲液中孵育,用氯仿纯化,并用2%酒精洗涤两次。
DNA提取方法在Kutuzova等人的文章中有详细描述。 (2017)。
为了通过分子方法确定物种并与其他已知的克雷萨酵母菌株进行比较,使用允许扩增物种特异性DNA区域的引物进行PCR:ITS1-5,8S-ITS2(引物ITS5 / ITS4,White等,1990),基因区域b -微管蛋白(Bt2a / Bt2b,Glass,Donaldson,1995)和翻译延伸因子1α(tef1α)(引物EF1-728F / EF1-986R,Carbone和Kohn,1999)。 使用Evrogen CleanUp试剂盒从凝胶中提取所需长度的扩增子。 使用终止子v3.1循环测序试剂盒(Applied Biosystems,CA,美国)在Applied Biosystems 3730xl自动测序仪(Applied Biosystems,CA,美国)上对扩增的区域进行测序。 所得核苷酸序列用于在美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank数据库中搜索匹配项。 系统发育分析是使用MEGA 6程序进行的(Tamura等,2013)。
对大果番茄(杜布拉瓦品种)和马铃薯块茎(嘎拉品种)的整个绿色水果进行了毒力测定。 另外,为了模拟损坏的水果和块茎的损坏,我们使用了相同水果和块茎的切片。 将块茎切成片放在潮湿的小室内,这是皮氏培养皿,底部有湿滤纸。 将载玻片放在纸上,然后在其上放置片状的块茎或水果。 整个块茎和水果也被放在底部装有湿滤纸的容器中。 在麦汁琼脂上生长5天后,在切片的中心(或块茎或水果的完整表面上)放置一块带有真菌菌丝的琼脂(5×5 mm)。
在实验室条件下,在琼脂营养培养基上进行真菌菌株对杀真菌剂抗性的评估。 我们研究了对杀菌剂Maxim,KS(活性成分氟地西尼,25 g / l),Quadris,KS(嘧菌酯250 g / l),Scor,EC(二苯甲康唑250 g / l)的敏感性(国家目录...,2020)。 在麦芽汁琼脂培养基上的陪替氏培养皿中进行评估,并添加所研究药物的活性物质浓度为0.1; 一; 1 ppm(mg / L)(对于氟地西尼和二氟康唑),10; 十; 1 ppm(对于嘧菌酯),在无杀菌剂的培养基中(对照)。 将杀菌剂添加到熔化并冷却至10°C的培养基中,然后将培养基倒入陪替氏培养皿中。 将带有真菌菌丝体的琼脂块置于培养皿的中央,并在黑暗中于100°C的温度下培养。 温育60天后,在两个相互垂直的方向上测量菌落的直径。 平均每个菌落的测量结果。 实验一式三份进行。 根据分析结果,计算出EC24,该浓度等于杀菌剂的浓度,相对于杀菌剂控制,菌落的径向生长速度减半。
结果与讨论
在带有麦芽汁琼脂的培养皿上,真菌形成带有白色絮状菌丝体的菌落。 菌丝体下的培养基变成红棕色。 当培养基变干时,真菌在小孢子虫中的单个和聚集分生孢子上形成两种类型的孢子。 大分生孢子是细长的圆柱形,间隔为一到三个,平均长度为27.2μm,取值范围为23.2至32.2μm,宽度-高达4.9μm(图1)。 微分生孢子的平均长度为14.3μm,取值范围为10.3至18.1μm,宽度最大为4.0μm。 所有宏观和微观形态特征都适合克氏伊氏菌属物种的变异范围(Cabral等,2012)。
物种特异性DNA区域(ITS,b-微管蛋白,TEF1α)的序列与我们之前研究的I. crassa菌株的序列完全一致(Chudinova等,2019,表1)。 为了研究在其他地区的I. crassa患病率并分析受影响的培养物的光谱,分析了GenBank数据库中的类似DNA序列(表1)。 重叠率为86%至100%。 “马铃薯” crassa菌株的所有三个DNA区域的序列与从荷兰的百合鳞茎和水仙的根以及从加拿大的人参根分离的菌株的序列相同。 我们无法在开放数据库中找到具有三个分析相似序列的其他克雷萨酵母。 然而,对沉积的ITS和β-微管蛋白序列的分析表明在英国郁金香叶上存在crassa。 分析加拿大的白杨根和意大利的山毛榉根以及沙特阿拉伯的马铃薯块茎时,发现了具有相似ITS序列的真菌(表1)。 这项研究的结果表明,cr。crassa具有全球分布,能够感染各种植物。
在第5天测定番茄和马铃薯切片的致病性时,病灶直径达到1.5 cm,所研究的菌株未感染整个番茄果实和完整的马铃薯块茎。 但是,萼片在番茄上受到影响。 为了从马铃薯块茎切片上生长的菌丝体中排除污染的可能性,将真菌分离物分离到纯培养物中。 它与亲本菌株完全相同。 显然,I。crassa是伤口寄生虫。
播种前用杀菌剂处理可减少植物在生长季节疾病的发展。 为了选择有效的杀菌剂,重要的是要评估其中哪些对伊拉沙酵母有效。 这项工作研究了广泛的杀真菌剂活性物质-氟狄索尼,嘧菌酯,苯乙康唑。 氟迪沙尼包含在种植前用于拌种种子和块茎的几种混合物中。 储液前,氟二恶唑(Maxim)也可用于处理块茎。 Difenoconazole和azoxystrobin也包括在许多用于处理种子材料的制剂中,以及旨在用于处理植物性植物的制剂中(国家目录...,2020)。
在具有不同浓度的活性物质的培养基(图2)上研究了克氏梭菌的生长速率:氟地西尼(EC50 = 0.4 ppm),嘧菌酯(EC50 = 4 ppm)和二苯并康唑(EC50 = 7.4 ppm)(表2)。 这些制剂被认为对克雷萨氏菌非常有效,因为它们的EC50明显低于用于治疗块茎的工作液中推荐的制剂浓度。 根据国家目录...(2020年),用于治疗马铃薯块茎的液体中氟地西尼的浓度为500至1000 ppm,嘧菌酯(用于治疗犁bottom底部的液体中)-3750-9375 ppm,敌苯康康唑(用于治疗植物性植物的液体中)-187.5– 625 ppm。
表1. Genbank数据库中可用的菌株18KSuPT2的物种特异性序列和克雷耶菌的序列的相似性
应变 | 寄主植物,排泄场所 | GenBank中保存的序列号,相似性百分比 | 链接 | ||
它的 | β微管蛋白 | TEF1α | |||
17KSPT1和18KSuPT2 | 科斯特罗马地区马铃薯块茎 | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al。,2019,这项工作 |
哥伦比亚广播公司 158/31 | 水仙根,荷兰 | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral等,2012 |
哥伦比亚广播公司 139/30 | 荷兰百合灯泡 | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | 加拿大人参根 | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
右轴235138 | 英国郁金香叶 | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | 丹顿,丹顿,2014 |
MT294410 | 加拿大白杨根 | MT294410 100 | ND | ND | 拉姆斯菲尔德(Ramsfield)等人,2020年 |
ER1937 | 意大利比奇 | KR019363 99.65 | ND | ND | 提扎尼,海吉,莫塔。 直接提交 |
考夫19 | 马铃薯块茎,沙特阿拉伯 | HE649390 98.3 | ND | ND | 盖尔巴里(Gherbawy),2013年 |
ND =未存入
表2.毛伊兰菌对杀真菌剂的抗性
(活性物质) | EC50,ppm | ||||
3天 | 5天 | 7天 | |||
控制 | 17± 2 | 33± 5 | 47± 3 | ||
堪萨斯州Quadris(fsoxystrobin) | 18± 1 | 34± 2 | 48± 2 | ||
11± 1 | 11± 1 | 12± 1 | |||
11± 1 | 11± 1 | 12± 1 | |||
堪萨斯州马克西姆(fludioxonil) | 16± 1 | 28± 2 | 48± 2 | ||
7± 1 | 13± 3 | 19± 4 | |||
5± 1 | 12± 1 | 17± 5 | |||
EC Skor(二苯甲康唑) | 18± 1 | 35± 2 | 48± 1 | ||
11± 1 | 24± 3 | 35± 4 | |||
11± 1 | 13± 1 | 17± 3 |
在我们的工作中,从科斯特罗马和莫斯科(Chudinova等人,2019)地区的马铃薯块茎中分离出克雷萨菌。 在分析沙特阿拉伯马铃薯块茎的真菌菌群时,发现了具有与ITS相同的ITS序列的高比例真菌菌株(Gashgari和Gherbawy,2013)。 显然,Crassa I.在马铃薯上并不罕见。 我们的实验表明,真菌可以感染受损的番茄果实。 从文献中知道,crassa能够腐生在土壤中腐生(Moll等人,2016),并能影响多种植物,甚至是在分类学上相距甚远的植物,例如水仙花,百合,人参,白杨和山毛榉(表1)。一)。 显然,许多野生和园林植物都可以作为crassa的储备。 以上表明,在制定保护措施时,有必要考虑到用这种真菌影响马铃薯块茎的可能性。 用于治疗马铃薯块茎的广泛制剂含有氟地西尼,嘧菌酯和苯乙康唑,已显示出高抗I. crassa的杀真菌功效。
这项工作得到了俄罗斯基础研究基金会(授权号20-016-00139)的支持。
该文章发表在《植物保护公报》上,2020年,第103页(3)