D. Yu。Ryazantev,E.M。Chudinova,L。Yu。Kokaeva,S。N. Elansky,P.N。Balabko,G。L. Belova,S.K。Zavriev
植物致病真菌炭疽菌会导致马铃薯和西红柿中的炭疽病和块茎黑斑病。 通过形态特征,它们通常很难与其他微生物引起的疾病区分开。 在绿色番茄果实上,该病可能没有症状,仅在成熟的红色果实上表现出来。 为了快速,准确地诊断病原体,提供了实时PCR测试系统。 为了开发测试系统,确定了从俄罗斯不同地区的马铃薯块茎分离的45 C. coccodes菌株的甘油三磷酸脱氢酶基因的核苷酸序列。
根据获得的结果和对GenBank数据库中其他物种相似序列的分析,设计了C. coccodes的物种特异性引物和探针。 为了检查所建立的测试系统的特异性,使用从15种与番茄和马铃薯植物相关的寄生和腐生真菌(尖酸镰刀菌,黄萎病菌,菜豆腐烂病,链格孢,链格孢菌)的纯培养物中分离的DNA进行PCR。桑黄(Phellinus ferrugineovelutinus),Stemphylium vesicarium,Helminthosporium solani,Phomopsis phaseoli,Neonectria radicicola,Rhizoctonia solani,Penicillium sp。,Cladosporium fulvum,C。cladosporioides)。 在20-27个阈值循环中确定了炭疽菌DNA的存在,而在40个循环后检测到其他物种或未检测到其他物种。 该测试系统可以可靠地检测被分析的PCR混合物中的C.coccodes DNA浓度超过0.01 ng / mm3。 使用开发的测试系统,调查了具有真菌病症状的番茄叶片和无该病外部症状的马铃薯块茎中C.coccodes的存在。 从克拉斯诺达尔地区两个不同的块茎田中采集具有真菌感染症状的叶子-从科斯特罗马,莫斯科,卡卢加州,下诺夫哥罗德州的田间采集。 在克拉斯诺达尔地区发现了一片含C. coccodes DNA的番茄叶片; 在科斯特罗马,莫斯科,卡卢加州地区生长的5个块茎样品中检测到该病原体的DNA显着存在。
介绍
炭疽菌属的真菌是危险的植物病原菌,会影响谷物,蔬菜,草药,多年生水果和浆果植物。 该属无处不在的物种之一,Colletotrichum coccodes(Wallr)。
休斯是炭疽病和马铃薯和西红柿黑斑的病原体,并引起茄科其他许多植物的病害,包括。 杂草(Dillard,1992)。 C. coccodes感染植物,茎基部,叶子和果实的所有地下部分(Andrivon等,1998; Johnson,1994)。 在被感染的马铃薯块茎的果皮上,观察到边缘出现模糊不清的灰斑,在其上清晰可见孢子形成和微菌核的黑点。 在储存过程中,块茎果肉中会形成内容物变软的溃疡,即该病进入炭疽病阶段,但是这种病极为罕见。
同时,炭疽病(带有小黑点的皮肤溃疡)的症状在番茄果实上很常见。 在叶子上,C.coccodes的症状表现为黑褐色斑点,通常以黄色组织为边界(Johnson,1994)。
块茎上出现黑点会破坏其外观,这在出售水洗的红皮土豆时尤为明显。 果皮剥落会导致过度蒸发并增加存储损失(Hunger,McIntyre,1979)。 对其他植物器官的损害会导致产量损失,这在开阔地和封闭地均可见(Johnson,1994; Tsror等,1999)。 由C.coccodes引起的疾病在包括俄罗斯在内的世界几乎所有马铃薯生产地区都很常见(Leesa,Hilton,2003; Belov et al,2018)。 由于现有杀真菌剂对C.coccodes的有效性不足和缺乏抗性品种,因此难以控制这些疾病(Read,Hide,1995)。
C.coccodes接种物可以在种子块茎中存活(Read,Hide,1988; Johnson等,1997),番茄种子(Ben-Daniel等,2010)可以在土壤中,植物残骸上存活很长时间(Dillard,1990)。 ; Dillard,Cobb,1993年)和杂草中(Raid,Pennypacker,1987年)。 许多作者的著作(Read,Hide,1988; Barkdoll,Davis,1992; Johnson等,1997; Dillard,Cobb,1993)表明,马铃薯和番茄的病害发展很大程度上取决于种子和种子中接种物的存在。泥。 因此,为了使疾病的损失最小化,有必要诊断(包括定量)种子材料,土壤,马铃薯块茎和放置的番茄种子中真菌的繁殖。 土壤和植物材料的形态学诊断只能通过存在小菌核来进行,但是在其他类型的真菌中也可以发现。
块茎上的症状与真菌Helminthosporium solani引起的银the结石非常相似。 将Colletotrichum coccodes和Helminthosporium solani分离到纯培养物中是相当困难的,并且由于在营养培养基上生长缓慢而需要很长时间。 为了快速识别Colletotrichum编码,必须使用仪器诊断方法。 最方便的方法是聚合酶链反应(PCR)及其修饰-实时PCR。 当前,欧洲和美国使用由英国研究人员(Cullen等,2002)开发的针对rDNA ITS1区域的测试系统。 它的使用在俄罗斯分离株的分析中显示了良好的结果(Belov et al,2018)。 但是,C。coccodes高度可变,从单个DNA序列中检测出来可能导致假阴性结果。 为了获得更可靠的诊断,需要对几种特定于物种的DNA序列进行分析,与此相关的是我们已经开发出了一种原始的测试系统,该系统可以通过3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的序列来识别C. coccodes。
材料和方法
为了评估创建的测试系统的有效性和特异性,我们使用了15种真菌的纯培养物,由作者从受影响的番茄,马铃薯块茎的叶子和果实样品中分离出来(表1)。 为了分离,取具有真菌感染症状的植物的器官,每灌木丛不超过一个器官。
将一片有果皮的块茎切片,番茄果实切片和患病叶片置于双目显微镜下,然后将菌丝体,孢子或一片组织转移到带有尖锐解剖针的皮氏培养皿中的琼脂培养基(麦芽汁琼脂)上。 将分离物在4°C下保存在试管中的琼脂斜面上。
收获后立即将番茄叶子样品用于分析真菌病症状(在田间),将其置于70%的乙醇中,直到分离DNA为止。 马铃薯块茎被送到实验室,去皮(2×1厘米),并在–20°C下冷冻。 冷冻保存直至DNA分离。
用于分离DNA的纯真菌培养物在豌豆液中生长。 从液体培养基中除去真菌的菌丝体,在滤纸上干燥,在液氮中冷冻,匀浆,在CTAB缓冲液中温育,用氯仿纯化,用异丙醇和0.5M乙酸钾的混合物沉淀,并用2%的乙醇洗涤两次。 所得的DNA溶解在去离子水中,并保存在–70°C(Kutuzova et al。,20)。 使用HS DNA定量试剂盒在Qubit 2017(Qiagen,Germany)上检测双链DNA的DNA浓度。 将醇化和冷冻的样品在液氮中研磨,然后如上所述进行DNA提取(对于纯真菌培养物的菌丝体)。
表1.使用过的真菌菌株的来源
蘑菇名称 | 植物,器官 | 选择地点 |
---|---|---|
炭疽菌(Coletotrichum)编码1,C.编码2,C.编码3,Ilyonectria crassa,根瘤菌 | 马铃薯块茎 | 科斯特罗马地区,第一代马铃薯块茎,品种Red Scarlett |
炭疽菌coccodes 4 | 马铃薯叶 | 代表约什卡尔奥拉马里·艾尔(Mari El) |
索氏蠕虫 | 马铃薯块茎 | 马加丹州帐篷,马铃薯块茎 |
富叶枝孢 | 番茄叶 | 莫斯科地区,大果番茄 |
番茄链格孢 | 番茄果实 | 全俄植物保护研究所真菌与植物病理学实验室的工作人员提交 |
黄萎病菌,Phomopsisphaseoli,Alternaria alternata,Phellinus ferrugineovelutinus,Stemphylium vesicarium,Cladosporium cladosporioides,Acrodontium luzulae,Penicillium sp。 | 番茄果实 | 克拉姆斯基地区克拉斯诺达尔地区,奶油等级 |
尖孢镰刀菌 | 小麦根 | 莫斯科地区。 |
PCR在DTprime扩增子(DNA-Technology)上进行。 对于PCR,使用了原始引物和甘油三磷酸脱氢酶基因物种特异性区域的探针:正向引物Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA,反向引物Coc280gdr-TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1。 引物扩增213 bp区域。
该反应需要50 ng的总DNA(用于分析叶子和块茎)和10 ng(用于分析纯真菌培养物的DNA)。 将反应混合物(35μl)通过石蜡层分成两部分:下部(20μl)包含2μl10×反应缓冲液(750 mM Tris-HCl,pH 8.8; 200 mM(NH4)2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1%Tween- 20),0.5mM的每种三磷酸脱氧核苷酸,每种引物7pmol和4pmol的可水解荧光探针; 上部含有1μl10×PCR缓冲液和1 U Taq聚合酶。
用石蜡分离混合物可以使试管在5°C的温度下长时间保存,并在10°C以上的温度下加热80分钟后为PCR提供热启动。 根据以下程序进行PCR:94.0℃-90s(1个循环); 94.0°C-30 s; 64.0°C-15 s(5个循环); 94.0°C-10 s; 64.0°C-15 s(45个循环); 10.0°C-储存。
结果与讨论
在俄罗斯不同地区从叶,茎,马铃薯块茎和番茄果实分离的45个菌株中确定了甘油三磷酸脱氢酶基因序列(Kutuzova,2018)。 将所有菌株的研究序列分为两个核苷酸不同的两组。 两组代表的核苷酸序列(编号为KY2和KY496634)存放在GenBank中。
使用BLAST程序检查了根据其基础设计的引物coc70gdf,coc280gdr和cocgdz探针(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)在炭疽菌和其他生物体中的甘油三磷酸甘油脱氢酶基因的所有序列上均可从GenBank数据库中获得。
没有发现与引物和探针高度同源的其他生物的DNA区域。
使用不同浓度的C.coccodes DNA,感染了炭疽病的马铃薯叶片DNA(2017年在Mari El,Red Scarlett品种中收集)以及受黑点影响的块茎皮(在Kostroma地区中收集,品种Red Scarlett,表2)。 为了确认块茎和马铃薯叶中存在DNA,将C.coccodes菌株从它们中分离到纯培养物中。
测试系统的灵敏度分析结果表明,当其在PCR混合物中的总含量超过0.05 ng时,可用于成功诊断样品中C.coccodes DNA的存在。 这对于检测来说已经足够了,因为一个菌核平均含有0.131 ng,而一个孢子含有约0.04 ng DNA(Cullen等,2002)。 由英语小组开发的测试系统(Cullen等,2002)显示出相似的灵敏度(在34 ng DNA处的阈值循环0.05和在37 ng处的阈值循环0.005)。
在所有情况下,对包含C.coccodes的天然样品的分析使得可以可靠地揭示其在样品中的存在(表2)。 所提出的DNA分离方法也适用于天然植物样品的分析。
表2.确定用于实时PCR的鉴定炭疽菌coccodes的拟议测试系统的敏感性的确定
样本 | 样品中的DNA量*,ng | 门槛周期 | C.密码检测 |
---|---|---|---|
菌丝菌 | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
块茎皮1 | 50 | 32 | + |
块茎皮2 | 50 | 30 | + |
块茎皮3 | 50 | 31.5 | + |
马铃薯叶 | 50 | 29.5 | + |
注意。 *混合使用PCR产物。
在从15种真菌提取的DNA样品上测试了测试系统的特异性。 作者从受影响和健康的水果和番茄,马铃薯块茎的叶子中分离了所有菌株。 从小麦根中分离出一种菌株(表1)。 在从果实表面分离的物种中,还有一些对番茄无致病性的物种(例如,桑黄(Phellinus ferrugineovelutinus))。
研究表明,在20–27的阈值循环中检测到了C.coccodes DNA,而在第40循环之后未检测到其他真菌物种或未发出信号,这可归因于非特异性噪声效应(表3)。
表3.检查测试系统中各种蘑菇的类型
蘑菇名称 | 门槛周期 |
炭疽菌 1 | 20.9 |
C.coccodes 2 | 22.6 |
C.coccodes 3 | 23 |
C.coccodes 4 | 22 |
尖孢镰刀菌 | > 40 |
黄萎病菌 | > 40 |
茄子枯萎病 | > 40 |
菜豆 | > 40 |
链格孢 | > 40 |
番茄 | > 40 |
索氏蠕虫 | > 40 |
桑黄 | > 40 |
茎囊泡 | > 40 |
克雷耶菌 | > 40 |
枝孢梭菌 | > 40 |
黄花茶 | > 40 |
芦荟 | > 40 |
青霉 SP。 | > 40 |
注意。 *所有样品中的DNA量均为10 ng。
所开发的测试系统用于鉴定具有坏死性病原体症状和无明显症状的种薯块茎的番茄叶片样品中的C.coccodes。 为了进行研究,我们采用了在科斯特罗马,莫斯科,卡卢加州,下诺夫哥罗德地区种植的不同品种的块茎。 样品中C.coccodes DNA的存在被认为是重要的,在分析中其阈值循环未超过35。该阈值的选择基于0.05 ng C.coccodes DNA的可靠测定(阈值循环33.5,表2)和以下事实:在超过40个阈值循环时,诊断出其他一些真菌的非特异性DNA。 通过这种方法,在科斯特罗马,莫斯科,卡卢加州地区和克拉斯诺达尔地区Yeisk地区的一片番茄叶片中生长的5个块茎样品中检测到了明显存在的C. coccodes DNA(表4、5)。
表4.马铃薯块茎上炭疽菌编码的检测*
样品编号 | 各种土豆 | 增长的地方 | C.密码检测 | 门槛周期 |
---|---|---|---|---|
1 | 红色猩红色 | 科斯特罗马地区 | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | 桑特 | 莫斯科地区。 | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | 茹科夫斯基早期 | 莫斯科地区。 | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | 莫莉 | 卡卢加地区。 | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | 幻想 | 卡卢加地区。 | - | |
15 | 节日 | 下诺夫哥罗德地区。 | - | |
16 | - |
注意。 *所有样品中的DNA量均为50 ng。
表5.番茄叶片上炭疽菌编码的检测*
样品编号 | 增长的地方 | C.密码检测 | 门槛周期 |
---|---|---|---|
1 | 克里米亚区克拉斯诺达尔地区 | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Yeisk District克拉斯诺达尔地区 | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
*所有样品中的DNA量均为50 ng。
我们创建的测试系统在灵敏度和特异性方面不逊于英国研究人员开发的测试系统(Cullen等,2002),适用于植物样品的分析。 它在种子块茎分析中的应用使得鉴定块茎中的C.coccodes DNA成为可能,而没有外部破坏迹象,并成功地分析了叶子的感染。
迄今为止,在俄罗斯尚未进行马铃薯块茎对C.coccodes侵染的分析。 我们的第一项研究表明,在俄罗斯联邦不同地区种植的16种经过测试的块茎中,有5种含有C. coccodes。 这表明马铃薯块茎黑斑病在俄罗斯是一种常见的马铃薯病,其在减少马铃薯作物的数量和质量中的作用被低估了。
番茄叶片的分析表明,克拉斯诺达尔地区Yeisk地区的一片叶片中存在大量隐球菌DNA。 较早时,当使用英国测试系统检查俄罗斯南部的番茄田时(Cullen等,2002),发现含有C. coccodes的叶子,并且在某些田地中发现了感染C. coccodes的叶子的比例很高(Belov等, 2018)。 在莫斯科地区的克拉斯诺达尔和滨海边疆区,我们发现了番茄果实,从中我们成功分离出纯种C. coccodes。 在俄罗斯,番茄中的C.coccodes可能比现在所认为的更为广泛,其危害性也被低估了。
因此,迄今为止,已经积累了关于马铃薯和番茄中C.coccodes的广泛分布的足够信息。
为了更好地了解这种真菌在马铃薯和番茄疾病发展中的作用,有必要监测其在俄罗斯的流行情况,研究土壤和种子感染的作用,以及黑斑在储存过程中损失的作用。 PCR诊断程序的使用可以大大促进这项工作,同时使用两个测试系统将大大提高分析的准确性。
这项工作得到了俄罗斯科学基金会第18-76-00009号的资助。
该文章发表在《真菌学与植物病理学》杂志上(第54卷,1年第2020期)。